小鼠卵母细胞准备实验程序

一．玻璃吸管的制作（收集、处理卵母细胞）：

器材：

硬玻璃毛细管（直径1.5毫米）

酒精灯

橡皮软管和吹嘴

玻璃试管，金属帽，烘箱

钻石笔

操作：

（1）在火焰上旋转玻璃管，使其变软；

（2）迅速拉管，可以不拉断，内径大约200微米；

（3）在适当的部位切开，切口要整齐。也可直接把玻璃管拉断。

（4）将几个拉好的吸管放在玻璃管里，如果必要的话，可在烘箱里消毒。一个便捷的吸管固定部分可由一个吹嘴和一个管子构成。

二．打开腹腔：

器材：

70%或90%酒精（盛于挤压瓶中）

吸湿试纸

眼科剪、外科剪各一把

镊子两把（钟表镊子）

酒精灯（用于消毒）

酒精棉球

操作：

（1）迅速把老鼠放在笼子顶上，这时老鼠用前爪紧紧抓住栅栏。用拇指和食指压住老鼠的头，然后向后拉它的尾巴。这个动作并不剧烈，用力很小。当然也可以用铅笔来压住老鼠的头。

（2）让老鼠躺在吸纸上，然后用70~90%酒精浸透它，这一步是为了降低解剖过程种鼠毛的污染。

（3）夹起皮肤，用剪刀在中线制作一个小的切口（切口位置并不重要），然后抓住切口两端向头尾两侧拉，直到暴露出整个腹部，并不粘上毛发。用镊子和剪刀切开腹膜。拖出内脏，寻找子宫角、输卵管和卵巢。

三．卵母细胞收集器材：

超排母鼠

35毫米培养皿

HCZB培养液

含透明质酸酶的HCZB培养液

消毒吸管

体式显微镜（20×和40×）

操作：

卵母细胞可以在注射前几小时收集。按以上操作处理，可选择在上午7~8：00取卵母细胞。

（1）按上述方法打开老鼠体腔。用镊子夹住一个子宫角的上端，轻轻拖动，把子宫角、输卵管、卵巢和脂肪都拖出体腔。我们将看到子宫系膜，它把生殖道和体壁连在一起，而且由明显的血管。用闭合的虹膜剪的尖端在子宫系膜上穿一个洞。

（2）拖住输卵管、卵巢和脂肪，在卵巢和输卵管之间剪断。

（3）室温下，输卵管和与它连接的子宫部分可以被转移到含有HCZB的35毫米的培养皿中。几个老鼠的输卵管都可放在同一个培养皿中。

（4）新排的卵母细胞被卵丘细胞颗粒包围着，在输卵管上端或壶腹部能看到。壶腹部在这时比平时大多了。输卵管漏斗部在排卵期间也变大了，在20倍的显微镜下就能着到。转移一个输卵管到含添加透明质酸酶（300微克/毫升）的HCZB的35毫米的培养皿中。室温下，放到20或40倍的立体显微镜下。用一把镊子夹住靠近输卵管膨大的漏斗部的部位，把输卵管固定在培养皿底部。用另一把镊子撕开靠近存放卵母细胞的部位，把卵丘卵母细胞复合体释放出来。如果卵丘卵母细胞复合体没有释放出来，就用镊子轻轻挤压输卵管让其释放出来。如果卵丘卵母细胞复合体粘在输卵管外壁上，把输卵管在透明质酸酶中放上几分钟，当消化酶除掉了粘性的颗粒细胞，卵丘卵母细胞复合体就会释放出来了。如果卵丘卵母细胞复合体粘在剪刀上，仅仅把剪刀拿出培养皿，这样由于水的张力的作用，卵丘卵母细胞复合体会重新回到培养皿底部。

（5）让卵丘卵母细胞复合体和透明质酸酶共孵几分钟，直到颗粒细胞完全除掉。如果必要的话，可以用吸管吹打卵子几次，但当颗粒细胞脱落后，卵母细胞在透明质酸酶中不能超过1分钟。这样是有害的。用吸管转移卵母细胞到新的含HCZB的培养皿中，冲洗掉透明质酸酶。然后转移到CZB中37℃培养，直到需要（小于3.5小时）。